针对目标蛋白抗体把蛋白-RNA复合物沉淀下来，并对复合物上的RNA进行测序或对目标RNA进行qRCR表达分析。
4.2 RNA pull-down+MS/WB/qPCR/RNA-Seq
设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，蛋白质谱检测或WB检测与RNA结合的蛋白。设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，qPCR检测或RNA-seq检测与RNA结合的RNA。
4.3双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验检测两个基因之间的互作。
4.4病 毒液以及siRNA设计
提供circRNA过表达以及干扰慢病 毒，腺病毒以及设计siRNA。
云序微量样本文章列表
云序生物作为以高通量测序技术为依托的科研服务公司，拥有丰富的微量样本测序经验，为众多临床与基础科研研究者提供了高质量的科研服务，助力客户发表过众多外泌体的SCI文章。
, 文章导读
外泌体是细胞分泌的大小为30-200nm的盘状囊泡，它在人体体液中分布广 泛。2013年，科学家通过研究外泌体细胞囊泡调控机制获得诺贝尔奖，这使外泌体开始被广 泛关注，随着研究的深入，人们发现外泌体可作为细胞间信息交流的桥梁，在细胞间往来穿梭进行信息传递。另外，外泌体与疾病的发生尤其是在肿 瘤中起到十分关键的作用，因此，外泌体也成为了研究疾病以及靶向治 疗的切入点。
尽管外泌体的研究十分火热，但前期研究主要集中在外泌体的信息传递以及外泌体中microRNA的作用机制等方面，关于外泌体中环状RNA的研究仍方兴未艾，今 天小编就近日新发表的三篇外泌体环状RNA高 分文章进行解析，希望能够使大家对外泌体中的环状RNA的研究有一些新的认识。
文章展示
1.肝ai细胞来源的外泌体circUHRF诱导自然杀伤细胞的衰竭，影响抗PD1治 疗的耐药性
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：15.302
发表时间：2020.6.27
文章链接：Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma
2020年6月27日，Molecular Cancer（IF=15.302）杂志上发表了一篇题为“Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma”的文章，文中对肝ai（HCC）细胞分泌的外泌体中circUHRF1的研究发现，circUHRF1可以通过与miR-449c-5p形成海绵机制从而影响其下游基因TIM-3的表达，抑 制自然杀伤细胞（NK）功能并提高了抗PD1免疫疗法的耐药性。
（1）circUHRF1在肝ai组织中表达上调
通过环状RNA测序数据分析得到UHRF1在肝ai组织中表达上调，并在其病理过程中起重要作用。后通过qPCR技术检测HCC中的标志基因UHRF1来源的14个circRNA，发现hsa_cic_0048677(circUHRF1)是肝ai组织中表达量高的环状RNA。并且在HCC组织中circUHRF1的表达高于非肿 瘤组织。临床生理表型显示circUHRF1表达高的患者中肿 瘤体积较大，血液中NK细胞比例较低，微血管浸润较多。Kaplan-Meier生存分析显示，circUHRF1高表达患者伴随临床预后不良。综上所述，HCC细胞中circUHRF1表达上调与患者预后不良相关，并表明circUHRF1表达上调可能参与了HCC的进展。
作者从六种肝ai细胞系中分离并利用电镜（TEM）和WB鉴定了相应的外泌体。qPCR显示HCCLM3和SMMC-7721细胞系衍生的外泌体circUHRF1的表达高。为了研究circUHRF1是否可以由HCC细胞通过外泌体递送到HCC患者血浆中。进行了qPCR鉴定了血浆外泌体circUHRF1，结果显示HCC患者血浆外泌体circUHRF1水平较高，肿 瘤切除后血浆外泌体circUHRF1水平降低，肿 瘤复发患者血浆外泌体circUHRF1水平升高，说明血浆外泌体circUHRF1主要由HCC细胞产生。此外，外泌体circUHRF1水平的升高常伴随着NK细胞比例降低。上述数据表明，外泌体circUHRF1可能是决定NK细胞相关免疫逃避的关键分子。
为确定HCC细胞衍生的外泌体circUHRF1是否可以诱导NK细胞功能异常，作者将NK细胞与HCCLM3和SMMC-7721细胞进行共培养。结果表明，与SMMC-7721和HCCLM3细胞共培养的NK细胞中分泌IFN-γ和TNF-α受到抑 制且circUHRF1表达的明显增强，但这两种作用可以被外泌体抑 制剂GW4869所阻断。为进一步研究HCC细胞是通过外泌体circUHRF1介导NK细胞功能障碍，作者利用shRNA敲低了SMMC-7721和HCCLM3 细胞中circUHRF1的表达，qPCR显示在敲低circUHRF1的肝ai细胞中，外泌体circUHRF1的表达明显降低，从而改善NK细胞中IFN-γ和TNF-α的分泌受损。这些结果说明，HCC通过外泌体circUHRF1抑 制NK细胞功能。
作者利用生物信息学预测了14个miRNA，在NK-92细胞中进行circUHRF1-RIP以及qPCR，结果表明miR-449c-5p是NK-92细胞中一个与circUHRF1相互作用的miRNA。在NK-92细胞中进行抗AGO2抗体的RIP和生物素化miR-449c-5p的RNA pull-down实验，证明了circUHRF1可以直接与miR-449c-5p结合。此外经双荧光素酶报告实验和分别在NK-92细胞中过表达circUHRF1和miR-449c-5p，证明了在NK细胞中circUHRF1和miR-449c-5p可能相互靶向。此外单独过表达miR-449c-5p会明显抑 制肿 瘤的活性，但增加circUHRF1表达明显抑 制miR-449c-5p的肿 瘤抑 制功能，说明HCC衍生的外泌体circUHRF1通过miR -449c-5p相关途径抑 制NK细胞功能。
作者分析了NK细胞中预测的miR-449c-5p靶基因TIM-3，同样进行了双荧光素酶报告实验，结果显示miR-449c-5p能直接与靶基因TIM-3的3’UTR区直接结合。超表达miR-449c-5p后TIM-3表达明显降低。为了验证NK细胞中外泌体circUHRF1的持续上调吸附miR-449c-5p，从而导致TIM-3的表达上调造成HCC的免疫逃避这一观点。作者检测了miR-449c-5p单独或与circUHRF1共同转染的NK-92细胞中TIM-3的表达。结果显示，miR-449c-5p超表达导致TIM-3 mRNA和蛋白表达水平下降，而circUHRF1逆转了miR-449c-5p的抑 制作用。在体内同样证实了circUHRF1通过调控miR-449c-5p/TIM-3轴来阻碍NK细胞的功能。
为了进一步探讨circUHRF1在HCC中的作用，使用pLO5-ciR-circUHRF1上调了PLC / PRF / 5细胞中circUHRF1的表达。qPCR结果显示，在过表达circUHRF1的HCC细胞中，外泌体circUHRF1水平也明显上调。此外，使用PLC/PRF/5细胞构建肺转移的NOD/SCID小鼠模型(注射来自健康供者的NK细胞)。结果表明，在接种过表达circUHRF1细胞的肺转移小鼠内，血浆外泌体中circUHRF1水平更高，肺部的转移瘤结节更多及结节内NKG2D阳性细胞更少。说明，circUHRF1以外泌体和NK细胞依赖性的方式促进HCC进展。
分析了30例进行肝切除术并接受抗PD1免疫治 疗的HCC患者的资料并测定circUHRF1的表达水平，结果表明，PD组的circUHRF1水平明显高于SD组和PR组。此外，检测了30例HCC患者组织中NKG2D的表达水平。结果表明，与抗PD1治 疗敏感的HCC患者相比，抗PD1治 疗耐药的HCC患者中NKG2D的阳性细胞数明显减少。为直接评估circUHRF1对抗PD1治 疗的影响，通过皮下植入circUHRF1基因敲低的HCCLM3细胞或相应的阴性对照细胞来构建小鼠移植瘤模型。结果表明，植入circUHRF1基因敲低细胞的小鼠对抗PD1治 疗敏感，并伴随总生存率的提高。根据上述研究，过表达circUHRF1可以提高HCC对抗PD1治 疗的耐药性，而靶向circUHRF1可能是恢复HCC对抗PD1治 疗敏感性的有效方法。
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：15.302
发表时间：2020.6.29
文章链接：Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation
2020年6月29日，“Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation”，文中阐述了circSHKBP1能够在胃ai患者的肿 瘤和血清中高表达，并且可以被外泌体递送，通过海绵吸附miR-582-3p并抑 制HSP90的降解从而起到促ai作用，为胃ai（GC）的发病机理研究提供了新的理论基础。
作者首先通过外泌体环状RNA测序在8例GC组织和8例正常组织的样本中 共鉴定出119种差异表达的circRNA。qPCR发现circSHKBP1是GC中差异表达明显的circRNA。设计反式剪切位点引物扩增circSHKBP1并进行Sanger测序和RNase R实验，验证表明circSHKBP1是高度稳定的环状RNA。对来自GC患者的152对ai组织和正常组织进行ISH分析发现GC组织的circSHKBP1丰度远高于正常组织，且circSHKBP1的表达与晚期TNM分期、血管浸润和预后不良相关。
（2）血清外泌体的circSHKBP1来源于GC组织为了确定是否可以在血清外泌体中检测到circSHKBP1，作者收集了20对GC组织和健康组织的血清外泌体，通过电镜（TEM）和WB发现，胃ai患者血清外泌体来源的circSHKBP1比健康对照组更丰富。血清外泌体中circSHKBP1水平约为GC患者肿 瘤组织中circSHKBP1水平的6倍。研究胃切除手术前后血清外泌体的circSHKBP1水平，发现切除肿 瘤后外泌体circSHKBP1水平急剧下降，说明GC组织是外泌体circSHKBP1的来源。以上结果表明，circSHKBP1是一种来源于胃ai组织的circRNA，可以被外泌体有效地输送到循环系统中。此外，circSHKBP1的高表达与晚期TNM分期和GC预后不良相关，使其具有作为GC潜在分子标志物的潜力。
为了探索circSHKBP1是否影响GC细胞的生物学过程，分析了circSHKBP1在4种人GC细胞系（BGC823、HGC27、AGS和MGC803）和正常胃上皮细胞系GES1中的表达水平。结果表明，circSHKBP1在4个GC细胞系中均高表达。此外，来自BGC823细胞培养基的外泌体circSHKBP1在GC细胞系中也存在过表达。随后，以circSHKBP1反向剪接序列的siRNA来敲低circSHKBP1，用pcDNA3.1-CMV-circRNA载体构建circSHKBP1过表达质粒。CCK8和EdU检测和Transwell检测显示，沉默circSHKBP1明显抑 制GC细胞增殖、迁移和侵袭能力而过表达circSHKBP1则相反。此外，作者从转染了circSHKBP1质粒的BGC823和HGC27细胞培养液中提取外泌体，与未处理的GC细胞共培养。结果表明，外泌体circSHKBP1的过表达也影响了GC细胞的增殖、迁移和侵袭。综上所述，过circSHKBP1能促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭并且随着circSHKBP1在GC细胞中的表达，更多的circSHKBP1通过外泌体中干扰其他GC细胞的生物学功能。
鉴于circRNA海绵吸附miRNA的作用已被广 泛研究，且circSHKBP1在胞质中含量丰富，作者探索了circSHKBP1是否通过作为miRNA的海绵分子来发挥生物学功能。对BGC823细胞中的AGO2进行RIP，结果显示内源性circSHKBP1特异性地富集于AGO2。使用CircInteractome预测可以与circSHKBP1结合的潜在miRNA分子（miR-582-3p、miR-665、miR-1207和miR-4458）。qPCR、RNA pull-down和双荧光素酶报告实验证实只有miR-582-3p可以直接与circSHKBP1互作。综上所述，circSHKBP1可以充当miR-582-3p的海绵分子并降低miR-582-3p的表达。随后作者将miR-582-3p单独转染或与circSHKBP1质粒共转染到GC细胞中。CCK8和Transwell分析表明，miR-582-3p会抑 制GC细胞的增殖、迁移和侵袭，而过表达circSHKBP1则消除了它对GC细胞生长的抑 制作用，这表明circSHKBP1是通过海绵吸附miR-582-3p来发挥的促ai作用。
分析临床数据发现circSHKBP1高表达组的血管浸润率明显较高。使用生信分析网站找到了miR-582-3p的下游靶标HUR和EIF2S1，它们是VEGF（促进内皮细胞增殖）信号通路的一部分。WB分析显示，过表达circSHKBP1会促进HUR和VEGF的表达，而对EIF2S1无影响。此外，miR-582-3p模拟物可以降低BGC823细胞中HUR和VEGF的表达。同样，敲低circSHKBP1下调了HUR和VEGF，随后导入miR-582-3p抑 制剂可以恢复HUR和VEGF的表达水平。HUR的RIP实验证实，它可以与VEGF mRNA和miR-582-3p直接结合。检测GC组织中HUR mRNA的表达水平，发现HUR表达与miR-582-3p表达呈负相关，与circSHKBP1表达呈正相关。结果表明，circSHKBP1可以通过调节HUR来调控VEGF的表达。
在HGC27细胞中用circSHKBP1探针的RNA pull-down和蛋白质谱结果显示两个差异表达蛋白HSP90β和HSP90α（HSP90的异构体）在过表达circSHKBP1的GC细胞中富集。RIP实验显示，circSHKBP1能直接作用于HSP90。使用qPCR和ELISA分别检测HSP90的mRNA和蛋白水平，结果显示GC肿 瘤组织中的HSP90 mRNA和蛋白均上调且HSP90蛋白表达与circSHKBP1表达呈正相关。然而，在过表达circSHKBP1中使用CHX抑 制蛋白，HSP90的降解受到明显抑 制。由于泛素连接酶STUB1可以泛素化HSP90。使用蛋白酶体抑 制剂MG132处理时HSP90的降解速度减慢。结合上述研究，作者认为circSHKBP1和STUB1竞争性结合HSP90，通过IP分析获得证实。此外，HSP90的抑 制剂NMS-E973在体外削弱了circSHKBP1的促ai作用。这些结果表明，circSHKBP1可以直接与HSP90结合，并抑 制STUB1对HSP90的泛素化，从而促进GC的发展。
作者构建了circSHKBP1沉默株系（LV3-sh1、LV3-sh2）和超表达株系（LV5-circSHKBP1），将相应细胞接种到小鼠体内，发现源自LV3-sh1细胞的肿 瘤明显小于源自LV3-NC的，表明敲低circSHKBP1会抑 制肿 瘤生长。另外，将转导LV5-circSHKBP1和LV5-NC的细胞接种到裸鼠体内，并对每组中一半数量的小鼠每周给予两次VEGF抗体。发现源自LV5-circSHKBP1细胞的肿 瘤比源自LV5-NC细胞的肿 瘤更大且更重。此外，qPCR 鉴定血清外泌体和肿 瘤的circSHKBP1的表达，发现外泌体circSHKBP1依赖于ai组织circSHKBP1的表达，这证实了circSHKBP1可通过外泌体递送到其他部位，并可在循环系统中检测，这使其可能成为一种很有潜力的GC分子标志物。
为了探索circSHKBP1对体内胃ai转移的影响，作者将荧光素转染到上述5个细胞系，然后注入裸鼠体内。LV5-circSHKBP1和LV5-NC组中的一半的小鼠每周接受两次VEGF抗体处理。结果表明，敲低circSHKBP1可明显减少肺转移灶的数目和大小且ISH显示，敲低circSHKBP1会导致GC肺转移灶中的HUR和VEGF染色明显减少。而过表达circSHKBP1可以加重肺转移病变和增加HUR和VEGF染色。而VEGF抗体可以抑 制circSHKBP1诱导的ai细胞转移。
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：15.302
发表时间：2020.7.27
文章链接：Exosomal circPACRGL promotes progression of colorectal cancer via the miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 axis
2020年7月27日，发表于Molecular Cancer（IF=15.302）的“Exosomal circPACRGL promotes progression of colorectal cancer via the miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 axis”首 次揭示了来源于肿 瘤细胞外泌体的circPACRGL在大肠ai增殖和转移中的作用机制，为深入研究circRNA在大肠ai治 疗中的作用机制提供了新的理论依据。
为了探索外泌体在CRC中的作用机制，作者首先从CRC细胞系HCT116和SW480的上清液中分离出ai细胞衍生的外泌体。CCK8、伤口愈合实验和Transwell assay显示，过表达外泌体明显增强了CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。流式细胞仪分析显示，在过表达外泌体的CRC细胞中，凋亡细胞数目明显低于对照细胞，WB结果显示，CRC衍生的外泌体增加了ai细胞相关的蛋白水平。此外，测试了CRC衍生的外泌体在体内转移瘤模型中的作用，作者发现外泌体处理显明显加了HCT116细胞的转移。综上所述，CRC衍生的外泌体可促进CRC增殖、迁移和侵袭。
通过外泌体环状RNA测序分析了HCT116和SW480细胞外泌体（Ex-HCT116和Ex-SW480）的表达谱。Venn显示circPAGAL（也称为has_circ_0069313）是两个Ex组中上调明显的基因，并通过qPCR证实。qPCR显示在肿 瘤来源的外泌体刺激下，CRC细胞中circPACRGL的表达明显上调，且circPACRGL可能来源于肿 瘤衍生的外泌体。为了研究circPACRGL是否为CRC进展所必需的，作者进行了功能缺失分析，将circPACRGL-siRNA转染到HCT116和SW480细胞中敲低circPACRGL后，使用肿 瘤来源的外泌体刺激两种CRC细胞，显示circPACRGL mRNA表达明显增加。这些结果表明，circPACRGL主要来自肿 瘤来源的外泌体。
作者使用生物信息学数据库预测发现circPACRGL同时具有miR-142-3p和miR-506-3p的结合位点，双荧光素酶报告实验检测也证实miR-142-3p和miR-506-3p可与circPACRGL直接结合。此外，在CRC细胞来源的外泌体刺激的HCT116和SW480细胞中，miR-142-3p和miR-506-3p表达均明显降低。这些结果表明，circPACRGL可以海绵吸附miR-142-3p和miR-506-3p，并抑 制二者的表达。
使用生物信息学预测了miR-142-3p和miR-506-3p的下游靶基因TGF-β1。通过双荧光素酶报告实验，证实了TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p的共同靶基因。qPCR和WB分析进一步表明，转染miR-142-3p/miR-506-3p可明显降低TGF-β1的mRNA和蛋白水平。为了进一步证实miR-142-3p和miR-506-3p对TGF-β1的调节作用，作者使用miR-142-3p/miR-506-3p 处理CRC衍生的外泌体刺激的CRC细胞，结果显示导入CRC衍生的外泌体后，CRC细胞中TGF-β1的mRNA和蛋白水平均明显增加，而与miR-142-3p/miR-506-3p共同处理后，TGF-β1表达的促进作用被有效抑 制。综上所述，TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p的共同靶标。
根据以上数据，作者推测circPACRGL可能通过miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1轴来调控CRC细胞增殖、迁移和侵袭。CCK8结果显示，在CRC衍生的外泌体治 疗组（Ex-HCT116）中，CRC细胞增殖明显高于对照组。敲低circPACRGL明显降低了CRC细胞增殖，而miR-142-3p/miR-506-3p抑 制剂处理或过表达TGF-β1后，这种抑 制作用会相应减弱。在细胞凋亡实验中也观察到了类似的效果。接下来，划痕实验和Transwell分析均显示CRC衍生的外泌体可以增强CRC细胞的迁移和侵袭能力，而在circPACRGL敲低的细胞中则发生了相反的作用，CRC衍生的外泌体处理可以回补circPACRGL敲低细胞的迁移和侵袭能力。与CCK8和细胞凋亡检测结果一致，miR-142-3p / miR-506-3p抑 制剂处理或过表达TGF-β1明显促进了circPACRGL敲低细胞的迁移和侵袭能力。以上结果表明，circPACRGL通过调节miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1过程促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭。
上述研究表明，circPACRGL通过miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1过程促进大肠ai的发展。作者进一步探讨CRC衍生的外泌体circPACRGL是否也可以通过这个轴调节中性粒细胞的N1-N2分化。流式细胞仪检测结果显示，CRC衍生的外泌体可以增加N2中性粒细胞的百分比，这与N2标记物CD11b + / Ly6G + / Ly6Clow的上调相一致。相比之下，在circPACRGL敲低的细胞中，N2中性粒细胞的百分比明显降低，而加入CRC衍生的外泌体后，这种抑 制作用被取消。此外，miR-142-3p/miR-506-3p抑 制剂处理或过表达TGF-β1可以明显增加circPACRGL敲低细胞中N1-N2的分化。综上分析，CRC衍生外泌体的circPACRGL通过miR-142-3p /miR-506-3p-TGF-β1过程促进N1-N2中性粒细胞的分化。
总体来说，上述三篇研究通过外泌体提取、外泌体鉴定、外泌体环状RNA测序、qRT-PCR、Sanger测序、RNA pull-down+MS/WB、RIP以及双荧光素酶报告实验等方法（云序可提供以上服务），探究外泌体环状RNA通过海绵机制吸附miRNA进而调控下游疾病相关基因mRNA的表达过程，影响ai症发展进程。这为研究和理解生物体复杂的外泌体环状RNA调控机制，提供了比较完整的实验研究思路和方案，具有很强的理论先导性和示范性，也为疾病的调控和靶点提供了重要的理论依据。
云序外泌体环状RNA课题技术服务四大模块
01 外泌体的提取与鉴定
1.1 电镜
提取血清血浆或细胞上清中的外泌体后进行电镜观察。
1.2 NTA
检测外泌体粒径大小。
1.3 WB
验证外泌体标志蛋白CD9和TSG101等经典外泌体标志物蛋白。
02 外泌体样品测序服务
2.1外泌体全转录组测序
同时检测外泌体样品中mRNA、lncRNA和circRNA，获得全 面的转录组信息。
2.2外泌体环状RNA测序
充分去除外泌体样品中的线性RNA，特异性地检测环状RNA
2.3 外泌体LncRNA测序
云序生物提供的LncRNA测序同时检测外泌体样品中的LncRNA和mRNA。
2.4 外泌体mRNA测序
检测外泌体中的mRNA表达情况。
2.5外泌体miRNA测序
测序外泌体中的miRNA表达情况。
03筛选验证
3.1qRT-PCR
对选定目标RNA分子可进行qPCR检测服务，包括引物设计与表达鉴定。
3.2Sanger测序与RNase R酶耐受实验
对选定的环状RNA分子进行反式剪切位点引物设计，扩增后Sanger测序验证环状；使用