监管变革：从回避荧光到拥抱精准

前些年，细胞株开发领域对荧光细胞筛选技术持谨慎态度，主要体现在外源DNA/蛋白引入，用于生产治疗性蛋白（如抗体）的细胞株开发中，监管机构（如FDA、EMA）要求最终的生产细胞株尽可能“干净”，引入荧光蛋白基因及其伴随的选择标记基因（如抗生素抗性基因）被视为不必要的外源遗传物质，增加了产品的复杂性和潜在安全风险（如免疫原性）。这些外源基因必须在最终的生产主细胞库和工作细胞库中被移除或证明不存在，这增加了额外的验证成本、负担和风险。

近两年荧光标记技术兴起的转机来自于一项融合人工智能与基因编辑的可将生物药开发时间从6个月缩短至1.5个月的创新技术-智能定点整合。在2024年BPI US West会议上，Pfizer、Genentech、Takeda等巨头纷纷展示了各自的定点整合平台：Pfizer采用双质粒双位点策略，通过BxB1整合酶将两个不同载体分别整合到两个独立位点，用红绿荧光标记筛选无荧光转化子。

Pfizer演讲现场（BPI US West展会）^[1]

Genentech则开发了单一位点多质粒顺序整合技术，成功实现了一个knob-into-hole双抗的11g/L高表达；AbbVie和MSD的联合分析显示，传统细胞株开发平均耗时24-28周，而定点整合技术可缩短70%以上时间。

Genentech演讲现场（BPI US West展会）^[1]

国内也有一些定点整合平台，如大湾生物AlfaCell平台已与鼎康生物CDMO平台深度整合，为全球客户提供全流程加速服务；博安生物则在2024年10月推出了BA-Fastcell^®平台^[2]。

技术革新：智能定点整合的本质突破

智能定点整合技术（Intelligent Site-Specific Integration，SSI）是基因编辑技术、人工智能算法与自动化设备的完美融合。与传统随机整合（RTI）相比，它实现了从“盲目撒网”到“精准投放”的根本转变。

SSI带来的变革是全方位的，主要体现在四个关键维度：

开发速度飞跃

将传统24-28周的周期压缩至6周。大湾生物展示的数据显示，从DNA转染到获得研究细胞库（RCB）仅需1.5个月。深圳太力生物的服务明确承诺1.5个月内交付稳定高产单克隆。

产量质量双升

表达量普遍达5g/L以上，是传统方法的1.5-2倍。更值得关注的是，双抗正确配对率突破80%，产品纯度可达98.8%。稳定性也显著提升，达到100%稳定性传递。

成本大幅降低

仅用“1块96孔板”即可完成单克隆筛选，避免大量重复工作。Pfizer等企业的实践表明，定点整合技术可减少30%以上的开发成本。

监管路径优化

均一性极高的细胞池获得监管机构认可，成为IND时间线突破的新窗口。在BPI Asia 2024会议上，专家指出定点整合细胞株的数据一致性显著简化了审批流程。

SSI核心技术采用两步走策略：

第一步：荧光宿主细胞构建与筛选

利用CRISPR-Cas9等基因编辑工具，在CHO细胞基因组中筛选高转录活性区域，插入包含荧光蛋白（如GFP）及重组酶识别位点（如BxB1 attP位点）作为“着陆垫”（landing pad）。此阶段需筛选获得荧光均一、生长稳健的单克隆宿主细胞。

第二步：目的基因精准整合与筛选

将包含目标基因（如抗体序列）和同源重组臂的表达载体导入宿主细胞，利用重组酶介导的位点特异性重组，将目标基因精准置换荧光标记。成功整合的细胞会失去荧光信号，成为“无荧光转化子”。此阶段需筛选出成功整合的无荧光的阳性克隆。

Cytena单细胞打印机在智能定点整合技术中的应用

宿主细胞筛选阶段

基于荧光强度高效分选阳性宿主细胞，温和的喷墨技术确保细胞活力。

目的基因整合后细胞筛选阶段

目的基因整合后细胞筛选阶段：在一群荧光细胞中反向精准分选无荧光细胞（即成功整合的细胞），其喷嘴图像可提供单细胞来源的证据，单细胞率>95%。

Cytena设备的独特优势在于：分选温和、快速、单细胞率高，荧光和非荧光细胞都能高效分选、使用无菌一次性墨盒杜绝交叉污染、结合成像设备可提供完整的克隆生长追踪报告，完全满足FDA单克隆源性要求。

智能定点整合单克隆筛选流程图

站在生物制药工业化的转折点上，智能定点整合技术代表的不仅是效率提升，更是一种研发范式的根本转变——从随机试错走向理性设计，从人工操作迈向智能自动化。

然而，一个不可忽视的现实是：市场上定制一个采用智能定点整合技术开发的优质细胞株，价格往往高达上千万人民币。这对于许多研发管线丰富、项目迭代快的生物技术公司，尤其是处于发展关键期的Biotech而言，无疑是一笔沉重的负担，让不少企业望而却步。这高昂的“入场券”，反而点燃了另一股燎原之火——越来越多的企业不再满足于“购买服务”，而是开始战略性“投资未来”，着手自主组建智能定点整合技术平台！

自主平台的构建离不开关键设备的投入，Cytena单细胞打印机是平台的核心硬件，贯穿宿主细胞筛选和目的基因整合细胞筛选两大关键步骤，确保高效率、高活力、合规的单克隆分离。

参考资料：

【1】笔者亲历丨定点整合杀疯了的BPI US West现场

【2】博安生物定点整合细胞株开发平台BA-Fastcell®亮相BPI Asia 2024